聚丙烯酰胺凝胶电泳：技术原理与实验步骤详解

聚丙烯酰胺凝胶电泳：技术原理与实验步骤详解

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是一种广泛用于分离和分析蛋白质的生物化学技术。与其他电泳技巧相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳因其较高的分离分辨率及可处理的样品范围，成为生物分子研究中不可或缺的工具。这篇文章小编将深入探讨聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验原理、材料准备、实验步骤及注意事项，旨在帮助研究人员更好地掌握这项技术。

实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是基于电场中带电粒子的迁移。实验中常加入十二烷基磺酸钠（SDS），这是一种阴离子去垢剂。SDS能与蛋白质分子结合，形成SDS-蛋白质复合物，消除由于蛋白质本身带有的电荷差异所造成的迁移速率不一致。这样，蛋白质的迁移速度主要依赖于其相对分子质量。根据Shapiro等人的研究，当蛋白质的相对分子质量在15000至200000之间时，迁移率与其相对分子质量的对数呈线性关系。

实验材料与试剂

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的基本材料及试剂包括：

1. 聚合材料

– 30%丙烯酰胺溶液

– N,N’-亚甲基双丙烯酰胺

2. 缓冲液

– Tris-HCl缓冲液（pH8.8，pH6.8）

3. 电泳缓冲液

– 5×Tris-glycine电泳缓冲液

4. 其他辅助试剂

– SDS溶液

– DTT（双硫苏糖醇）

– 染色液与脱色液

实验步骤

1. 凝胶制备

为了进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，需要制备凝胶：

– 安装玻璃板，并配制10%分离胶溶液。

– 将分离胶溶液快速灌注至玻璃板间隙，防止气泡产生。

– 等待凝胶聚合，通常需要20至40分钟。

– 洗净凝胶表面，随后制备5%浓缩胶，并灌装至分离胶上方，插入梳子形成样品孔。

2. 样品制备与上样

– 通过离心收集细菌培养液，将菌体重悬于适量的缓冲液中，并加热处理以变性蛋白质。

– 装填电泳体系，加入适量的电泳缓冲液，并在样品孔中加8μL样品。

3. 电泳经过

– 连接电源，设置初始电压为8 V/cm，待染料前沿进入分离胶后，提升电压至15 V/cm。

– 观察电泳经过，一般需时80至150分钟，直到染料前沿接近凝胶底部。

4. 染色与脱色

– 卸下胶板，剥离凝胶并放入染色液中，室温下染色过夜。

– 用脱色液进行脱色，直到背景清晰，最后对凝胶进行拍照或保存。

实验注意事项

在实验经过中，应注意下面内容几点：

1. 所有试剂必须新鲜配置，尤其是含有TEMED的凝胶溶液。

2. 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应采取适当的防护措施。

3. 电泳经过中应避免气泡的产生，以保证电泳效果。

拓展资料与归纳

聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种重要的生物化学实验技巧，不仅在学术研究中得到了广泛应用，也在生物技术行业中扮演着关键角色。通过对其原理、材料、步骤及注意事项的深入领悟，研究人员能够更有效地进行蛋白质的分离与分析，推动生物学领域的提高。